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原代细胞的培养方法
文章来源:上海沪峰化工有限公司   添加时间:2020/10/22 11:46:22 点击率:881

原代细胞的培养也叫初代培养,是从供体取得组织细胞在体外进行的培养,是建立细胞系的第一步,是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开,生物学特性未发生很大变化,仍保留原来的遗传特性,也最接近和反映体内生长特性,适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。   

原代细胞往往有多种细胞组成,比较混杂,即使从形态上为同一类型(上皮样或成纤维样),但细胞间仍有很大差异。如果供体不同,即使组织类型、部位相同,个体差异也照样存在,原代细胞生物特性尚不稳定,如需做较为严格的对比性实验研究,还需进行短期传代培养。   

1、组织块培养法   

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法,也是早期采用培养细胞的方法,故原先被称为组织培养。其方法:为将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中,瓶壁可预先涂以胶原薄层,以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长,方法简便,利于培养,部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出,然后逐渐延伸,长成肉眼可以观察到的生长晕,5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮,此漂浮小块可随换液而弃去,由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片,可在显微镜下观察形态和用于实验研究。  

其培养方法如下:   

(1)按照前述方法取材,将组织剪成或切成1mm3大小的小块,并加入少许培养基使组织湿润。   

(2)将小块均匀涂布于瓶壁,每小块间距0.2 cm~0.5cm,一般在25ml培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20~30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。   

(3)培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养初期移动和观察时要轻拿轻放,开始几天尽量不去搬动,以利贴壁和生长,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。   

原代细胞培养-2   

2.消化培养法   

该方法是采用前述的消化分散法,将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维等)去除,使细胞分散形成细胞悬液,然后分瓶培养。   

某些特殊类型细胞,如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤,将在有关章节中叙述。   

3.悬浮细胞培养法   

对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。   

4.器官培养   

器官培养是指从供体取得器官或组织块后,不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养,其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和、并能存活,器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同,但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性,可用于重点观察细胞间的、排列情况和相互影响,以及局部环境的生物调节作用。

1. 器官培养的特殊的要求   

(1)需要特殊的培养条件 因器官离体培养,其营养和氧气仅靠自然渗透来供给,因此,培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死,其厚度或直径不宜超过1mm。   

(2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入 常采用以下两种方法:   

a. 将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。   

b. 提高培养基中的氧分压,一般需加注纯氧,提高氧分压时仍需保持5% co2,以维持ph。   

2. 器官培养的方法   

(1)将不锈钢网做成的支架,放置于培养皿中,高度为1/2皿高,使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。   

(2)将培养基加入平皿中,使培养液刚刚接触到滤膜,但不要使滤膜浮起。   

(3)将要培养的器官组织平放在滤膜上,一般厚度不要超过200μm,水平面积不超过10mm2,如为肝、肾不能大于1mm2。   

(4)将培养物置于co2培养箱内,并加注氧气,调整氧分压达90%,培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。   

(5)上述器官培养1~3周(每隔2~3天换液一次)后可用于实验和检测。


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